Tooted
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR tuvastuskomplekt 2019-nCoV jaoks
Eeldatav kasutus
Seda komplekti kasutatakse uue koroonaviiruse (2019-nCoV) kvalitatiivseks tuvastamiseks, kasutades kurgu- ja ninaneelu tampoone, bronhoalveolaarset loputusvedelikku ja röga. Selle toote tuvastamistulemus on ainult kliiniliseks võrdluseks ja seda ei tohiks kasutada ainsa tõendina kliinilise diagnoosi ja ravi määramiseks. Soovitatav on seisundi põhjalik analüüs koos patsiendi kliiniliste ilmingute ja muude laboratoorsete testidega.
Kontrolli põhimõte
Komplekt põhineb üheetapilise RT-PCR tehnoloogial. Tegelikult valiti amplifikatsiooni sihtpiirkondadeks 2019. aasta uue koroonaviiruse (2019-nCoV) ORF1ab ja N geenid. Spetsiifilised praimerid ja fluorestseeruvad sondid (N geeni sondid on märgistatud FAM-iga ja ORF1ab sondid on märgistatud HEX-iga) on loodud 2019. aasta uut tüüpi koroonaviiruse RNA tuvastamiseks proovides. Komplekt sisaldab ka endogeenset sisekontrolli tuvastussüsteemi (sisekontrolli geeni sond on märgistatud CY5-ga) proovide kogumise, RNA ja PCR amplifikatsiooni protsessi jälgimiseks, vähendades seeläbi valenegatiivsete tulemuste arvu.
Peamised komponendid
| Komponendid | Maht()48T/komplekt) |
| RT-PCR reaktsioonilahus | 96 µl |
| nCOV praimeri TaqMani proovide segu (ORF1ab, N geen, RnaseP geen) | 864 µl |
| Negatiivne kontroll | 1500 µl |
| nCOV positiivne kontroll (l ORF1ab N geen) | 1500 µl |
Oma reagendid: RNA ekstraheerimis- või puhastamisreaktiivid. Negatiivne/positiivne kontroll: positiivne kontroll on sihtfragmenti sisaldav RNA, negatiivne kontroll aga nukleiinhappevaba vesi. Kasutamise ajal peaksid need osalema ekstraheerimises ja neid tuleks pidada nakkusohtlikeks. Neid tuleb käsitseda ja utiliseerida vastavalt asjakohastele eeskirjadele.
Sisemine võrdlusgeen on inimese RnaseP geen.
Säilitamistingimused ja aegumiskuupäev
-20±5 ℃, vältida korduvat külmutamist ja sulatamist rohkem kui 5 korda, kehtib 6 kuud.
Kohaldatav instrument
FAM / HEX / CY5 ja muu mitmekanalilise fluorestsents-PCR-instrumendiga.
Näidisnõuded
1. Kohaldatavad proovitüübid: kurgutampoonid, ninaneelutampoonid, bronhoalveolaarne loputusvedelik, röga.
2. Proovide kogumine (aseptiline tehnika)
Neeluproovi võtmine: Pühkige mandleid ja neelu tagumist seina korraga kahe tampooniga, seejärel kastke tampooni pea proovilahust sisaldavasse katseklaasi.
Röga: Pärast patsiendi sügavat köha koguge köhitud röga keeratava korgiga katseklaasi, mis sisaldab proovivõtulahust; bronhoalveolaarne loputusvedelik：Proovivõtt meditsiinitöötajate poolt. 3. Proovide säilitamine ja transport
Viiruse isoleerimiseks ja RNA testimiseks mõeldud proovid tuleks testida nii kiiresti kui võimalik. Proove, mida saab 24 tunni jooksul tuvastada, saab säilitada temperatuuril 4 ℃; proove, mida ei saa 24 tunni jooksul tuvastada,
tundi tuleks hoida temperatuuril -70 ℃ või alla selle (kui säilitustingimust -70 ℃ ei ole, tuleks need
ajutiselt säilitatud temperatuuril -20 ℃ külmkapis). Proove tuleks transportimise ajal korduvat külmutamist ja sulatamist vältida. Proovid tuleks pärast kogumist laborisse saata niipea kui võimalik. Kui proove on vaja transportida pikkade vahemaade taha, on soovitatav neid säilitada kuivjääs.
Katsemeetodid
1 Proovi töötlemine ja RNA ekstraheerimine (proovi töötlemise ala)
RNA ekstraheerimiseks on soovitatav võtta 200 μl vedelat proovi. Seotud ekstraheerimisetappide kohta vaadake kaubanduslike RNA ekstraheerimiskomplektide juhiseid. Nii negatiivne kui ka negatiivne
Selle komplekti kontrollid olid ekstraheerimisel kaasatud.
2 PCR-reagendi ettevalmistamine (reagendi ettevalmistamise ala)
2.1 Eemaldage komplektist kõik komponendid, sulatage need ja segage toatemperatuuril. Tsentrifuugige enne kasutamist paar sekundit kiirusel 8000 p/min; arvutage vajalik reagentide kogus ja valmistage reaktsioonisüsteem ette järgmise tabeli kohaselt:
| Komponendid | N portsjonit (25µl süsteem) |
| nCOV praimer TaqMan sondisegu | 18 µl × N |
| RT-PCR reaktsioonilahus | 2 µl × N |
| *N = testitud proovide arv + 1 (negatiivne kontroll) + 1 (nCOVpositiivne kontroll) | |
2.2 Pärast komponentide põhjalikku segamist tsentrifuugige lühikest aega, et kogu tuubi seinal olev vedelik tuubi põhja langeks, ja seejärel jaotage 20 µl amplifikatsioonisüsteemist PCR-tuubi alikvoot.
3 Proovide võtmine (proovi ettevalmistamise ala)
Pärast ekstraheerimist lisage 5 μl negatiivset ja positiivset kontrolli. Testitava proovi RNA lisatakse PCR-reaktsioonikatsutisse.
Sulgege tuub tihedalt korgiga ja tsentrifuugige enne amplifikatsiooni tuvastamise alale viimist paar sekundit kiirusel 8000 p/min.
4 PCR amplifikatsioon (amplifitseeritud tuvastusala)
4.1 Asetage reaktsioonitoru instrumendi proovikambrisse ja määrake parameetrid järgmiselt:
| lava | Tsükkel number | Temperatuur(°C) | Aeg | kollektsioonsait |
| Tagurpiditranskriptsioon | 1 | 42 | 10 minutit | - |
| Eeldenaturatsioonn | 1 | 95 | 1 minut | - |
| Tsükkel | 45 | 95 | 15 sekundit | - |
| 60 | 30ndad | andmete kogumine |
Instrumendi tuvastuskanali valik: Valige fluorestsentssignaali jaoks kanal FAM, HEX, CY5. Referentsfluorestsentsi NONE puhul ärge valige ROX.
5 Tulemuste analüüs (seadistamiseks vaadake iga instrumendi katsejuhiseid)
Pärast reaktsiooni salvestage tulemused. Pärast analüüsi reguleerige logaritmilisel graafikul pildi põhjal baasjoone algväärtust, lõppväärtust ja läviväärtust (kasutaja saab seda vastavalt tegelikule olukorrale reguleerida, algväärtust saab seadistada 3–15 ja lõppväärtust 5–20). Akna lävel on läviväärtusjoon logaritmilises faasis ja negatiivse kontrolli amplifikatsioonikõver on sirge või läviväärtusest allpool.
6 Kvaliteedikontroll (test sisaldab protseduurilist kontrolli) Negatiivne kontroll: FAM, HEX ja CY5 tuvastuskanalite puhul puudub ilmne amplifikatsioonikõver.
COV positiivne kontroll: FAM ja HEX tuvastuskanalite amplifikatsioonikõver on ilmne, Ct väärtus ≤32, kuid CY5 kanali amplifikatsioonikõver puudub;
Ülaltoodud nõuded peavad olema täidetud samaaegselt samas katses; vastasel juhul on katse kehtetu ja seda tuleb korrata.
7 Tulemuste kindlaksmääramine.
7.1 Kui testproovi FAM- ja HEX-kanalites puudub amplifikatsioonikõver või Ct-väärtus on > 40 ning CY5-kanalis on amplifikatsioonikõver, võib järeldada, et proovis ei ole 2019. aasta uue koroonaviiruse (2019-nCoV) RNA-d;
.2 Kui testproovil on FAM- ja HEX-kanalites selged amplifikatsioonikõverad ning Ct-väärtus on ≤40, võib järeldada, et proov on 2019. aasta uue koroonaviiruse (2019-nCoV) suhtes positiivne.
7.3 Kui testproovil on selge amplifikatsioonikõver ainult ühes FAM-i või HEX-i kanalis ja Ct väärtus on ≤40 ning teises kanalis amplifikatsioonikõver puudub, tuleb tulemusi uuesti testida. Kui uuesti testimise tulemused on järjepidevad, võib proovi uue kanali suhtes positiivseks pidada.
koroonaviirus 2019 (2019-nCoV). Kui kordustesti tulemus on negatiivne, võib otsustada, et proov on 2019. aasta uue koroonaviiruse (2019-nCoV) suhtes negatiivne.
Positiivne hinnanguväärtus
Komplekti CT-referentsväärtuse määramiseks kasutatakse ROC-kõvera meetodit ja sisemise kontrolli referentsväärtus on 40.
Testi tulemuste tõlgendamine
1. Iga katset tuleks testida negatiivsete ja positiivsete kontrollide osas. Testi tulemusi saab määrata ainult siis, kui kontrollid vastavad kvaliteedikontrolli nõuetele.
2. Kui FAM- ja HEX-tuvastuskanalid on positiivsed, võib CY5-kanali (sisemise kontrollikanali) tulemus süsteemi konkurentsi tõttu olla negatiivne.
3. Kui sisekontrolli tulemus on negatiivne ja katseklaasi FAM- ja HEX-detektsioonikanalid on samuti negatiivsed, tähendab see, et süsteem on keelatud või toiming on vale – test on kehtetu. Seetõttu tuleb proove uuesti testida.
