Tooted
Lifecosmi SARS-Cov-2-RT-PCR tuvastuskomplekt 2019-nCoV jaoks
Eeldatav kasutus
Seda komplekti kasutatakse uue koroonaviiruse (2019-nCoV) kvalitatiivseks tuvastamiseks, kasutades kurgu tampooni, ninaneelu tampooni, bronhoalveolaarset loputusvedelikku ja röga. Selle toote tuvastamise tulemus on ainult kliiniliseks võrdluseks ja seda ei tohiks kasutada ainsa kliinilise diagnoosimise ja ravi tõendid.Soovitatav on seisundi terviklik analüüs koos patsiendi kliiniliste ilmingute ja muude laboratoorsete testidega.
Kontrolli põhimõte
Komplekt põhineb üheastmelisel RT-PCR tehnoloogial.Tegelikult valiti 2019. aasta uus koroonaviiruse (2019-nCoV) ORF1ab ja N geenid amplifikatsiooni sihtpiirkondadeks.Spetsiifilised praimerid ja fluorestseeruvad sondid (N-geeni sondid on märgistatud FAM-iga ja ORF1ab sondid on märgistatud HEX-iga) on loodud 2019. aasta uut tüüpi koroonaviiruse RNA tuvastamiseks proovides.Komplekt sisaldab ka endogeenset sisekontrolli tuvastamise süsteemi (sisekontrolligeeni sond, mis on märgistatud CY5-ga), et jälgida proovide kogumise, RNA ja PCR amplifikatsiooni protsessi, vähendades seeläbi valenegatiivseid tulemusi.
Peamised komponendid
| Komponendid | Helitugevus(48T / komplekt） |
| RT-PCR reaktsioonilahus | 96 µl |
| nCOV praimeri TaqMan proovisegu (ORF1ab, N geen, RnaseP geen) | 864 µl |
| Negatiivne kontroll | 1500 µl |
| nCOV positiivne kontroll (l ORF1ab N geen) | 1500 µl |
Oma reaktiivid: RNA ekstraheerimis- või puhastusreagendid.Negatiivne/positiivne kontroll: positiivne kontroll on sihtfragmenti sisaldav RNA, negatiivne kontroll aga nukleiinhappevaba vesi.Kasutamise ajal peaksid nad osalema ekstraheerimises ja neid tuleks pidada nakkavateks.Neid tuleb käidelda ja utiliseerida vastavalt asjakohastele eeskirjadele.
Sisemine võrdlusgeen on inimese RnaseP geen.
Säilitamistingimused ja kõlblikkusaeg
-20±5 ℃, vältige korduvat külmutamist ja sulatamist rohkem kui 5 korda, kehtib 6 kuud.
Kohaldatav instrument
FAM / HEX / CY5 ja muu mitme kanaliga fluorestsents-PCR instrumendiga.
Näidise nõuded
1. Kohaldatavad proovitüübid: kurgu tampoonid, ninaneelu tampoonid, bronhoalveolaarne loputusvedelik, röga.
2. Proovide kogumine (aseptiline tehnika)
Neelu tampoon: pühkige mandleid ja neelu tagumist seina kahe tampooniga korraga, seejärel sukeldage tampoonipea proovivõtulahust sisaldavasse katseklaasi.
Röga: pärast patsiendi sügavat köha koguge köhitud röga keeratava korgiga katseklaasi, mis sisaldab proovivõtulahust;Bronhoalveolaarne loputusvedelik: proovide võtmine meditsiinitöötajate poolt.3.Proovide ladustamine ja transport
Viiruse isoleerimiseks ja RNA testimiseks mõeldud proove tuleks testida niipea kui võimalik.Proove, mida saab tuvastada 24 tunni jooksul, võib säilitada temperatuuril 4 ℃;need, mida ei ole võimalik tuvastada 24
tundi tuleks hoida temperatuuril -70 ℃ või alla selle (kui ei ole säilitustingimusi -70 ℃, tuleks neid hoida
ajutiselt hoitud -20 ℃ külmikus).Proovid peaksid transportimise ajal vältima korduvat külmutamist ja sulatamist.Proovid tuleb saata laborisse võimalikult kiiresti pärast kogumist.Kui proove on vaja transportida pikkade vahemaade taha, on soovitatav säilitada kuivjää.
Katsemeetodid
1 proovi töötlemine ja RNA ekstraheerimine (proovi töötlemise ala)
RNA ekstraheerimiseks on soovitatav võtta 200μl vedelat proovi.Seotud ekstraheerimisetappide kohta vaadake kaubanduslike RNA ekstraheerimiskomplektide juhiseid.Nii negatiivset kui negatiivset
selle komplekti kontrollid osalesid ekstraheerimises.
2 PCR reaktiivi ettevalmistamine (reaktiivi ettevalmistamise ala)
2.1 Eemaldage komplektist kõik komponendid ning sulatage ja segage toatemperatuuril.Enne kasutamist tsentrifuugige mõni sekund kiirusel 8000 p / min;arvutage vajalik kogus reaktiive ja reaktsioonisüsteem valmistatakse ette järgmises tabelis näidatud viisil:
| Komponendid | N portsjon (25 µl süsteem) |
| nCOV praimer TaqMan sondisegu | 18 µl × N |
| RT-PCR reaktsioonilahus | 2 µl × N |
| *N = testitud proovide arv + 1 (negatiivne kontroll) + 1 (nCOVpositiivne kontroll) | |
2.2 Pärast komponentide põhjalikku segamist tsentrifuugige lühikest aega, et kogu toru seinal olev vedelik langeks katsuti põhja, ja seejärel jagage 20 µl amplifikatsioonisüsteem PCR-katsuti.
3 Proovide võtmine (proovi ettevalmistamise ala)
Pärast ekstraheerimist lisage 5 μl negatiivset ja positiivset kontrolli.PCR reaktsioonituubi lisatakse testitava proovi RNA.
Katke katseklaas tihedalt korgiga ja tsentrifuugige paar sekundit kiirusel 8000 p/min, enne kui viite selle amplifikatsiooni tuvastamise piirkonda.
4 PCR amplifikatsioon (amplifitseeritud tuvastamisala)
4.1 Asetage reaktsioonitoru instrumendi proovikambrisse ja seadke parameetrid järgmiselt:
| etapp | Tsükkel number | Temperatuur(°C) | Aeg | koguminesaidile |
| Tagurpiditranskriptsioon | 1 | 42 | 10 min | - |
| Eeldenaturatsioonn | 1 | 95 | 1 min | - |
| Tsükkel | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30ndad | andmete kogumine |
Instrumendi tuvastamise kanali valik: valige fluorestsentssignaali jaoks kanal FAM, HEX, CY5.Viitefluorestsents NONE, palun ärge valige ROX.
5 Tulemuste analüüs (seadistamiseks vaadake iga instrumendi katsejuhiseid)
Pärast reaktsiooni salvestage tulemused.Pärast analüüsi reguleerige vastavalt pildile lähteväärtust, lõppväärtust ja läviväärtust (kasutaja saab kohandada vastavalt tegelikule olukorrale, algväärtuseks saab määrata 3–15, lõppväärtuseks saab määrata 5~20, reguleerimine) logaritmilises graafikus Akna lävel on läve joon logaritmilises faasis ja negatiivse kontrolli võimenduskõver on sirge või lävejoonest allpool).
6 Kvaliteedikontroll (Testis on protseduuriline kontroll) Negatiivne kontroll: FAM, HEX, CY5 tuvastuskanalite jaoks puudub ilmne võimenduskõver.
COV positiivne kontroll: FAM- ja HEX-tuvastuskanalite ilmne võimenduskõver, Ct väärtus ≤32, kuid CY5 kanali võimenduskõver puudub;
Eespool nimetatud nõuded peavad olema samas katses täidetud samaaegselt;vastasel juhul on katse kehtetu ja seda tuleb korrata.
7 Tulemuste kindlaksmääramine.
7.1 Kui testitava proovi FAM- ja HEX-kanalites puudub amplifikatsioonikõver või Ct väärtus > 40 ning CY5 kanalis on amplifikatsioonikõver, võib järeldada, et 2019. aasta uut koroonaviirust (2019-nCoV) pole. RNA proovis;
.2 Kui analüüsitavas proovis on FAM- ja HEX-kanalites ilmsed amplifikatsioonikõverad ja Ct väärtus on ≤40, võib otsustada, et proov on 2019. aasta uue koroonaviiruse (2019-nCoV) suhtes positiivne.
7.3 Kui katseproovil on selge võimenduskõver ainult ühes FAM- või HEX-kanalis ja Ct väärtus on ≤40 ning teises kanalis ei ole võimenduskõverat, tuleb tulemusi uuesti testida.Kui kordustesti tulemused on järjepidevad, võib proovi hinnata uue suhtes positiivseks
koroonaviirus 2019 (2019-nCoV).Kui kordustesti tulemus on negatiivne, võib järeldada, et 2019. aasta uue koroonaviiruse (2019-nCoV) proov on negatiivne.
Positiivne hinnangu väärtus
Komplekti CT võrdlusväärtuse määramiseks kasutatakse ROC kõvera meetodit ja sisekontrolli kontrollväärtus on 40.
Testitulemuste tõlgendamine
1.Iga katset tuleks testida negatiivsete ja positiivsete kontrollide suhtes.Katsetulemusi saab määrata ainult siis, kui kontrollid vastavad kvaliteedikontrolli nõuetele
2.Kui FAM- ja HEX-tuvastuskanalid on positiivsed, võib CY5 kanali (sisejuhtimiskanali) tulemus süsteemi konkurentsi tõttu olla negatiivne.
3. Kui sisekontrolli tulemus on negatiivne ja ka katseklaasi FAM- ja HEX-tuvastuskanalid on negatiivsed, tähendab see, et süsteem on keelatud või toiming on vale, t test on kehtetu.Seetõttu tuleb proove uuesti testida.
